അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിന്റെ ഉപയോഗവും മുൻകരുതലുകളും
1) അനുയോജ്യമായ അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ട്യൂബ് തിരഞ്ഞെടുക്കുക.വിവിധ രാസവസ്തുക്കളോടുള്ള സഹിഷ്ണുതയുടെ നിലവാരത്തിൽ UF മെംബ്രണുകൾ വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കുക.സാധാരണഗതിയിൽ, 10 kDa മോളിക്യുലാർ വെയ്റ്റ് കട്ട്-ഓഫ് ഉള്ള അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ട്യൂബുകൾ ഒരു മോളിക്യുലാർ വെയ്റ്റ് കട്ട്-ഓഫ് ഉപയോഗിച്ച് തിരഞ്ഞെടുക്കാം, അത് 35 kDa പോലുള്ള താൽപ്പര്യമുള്ള പ്രോട്ടീന്റെ തന്മാത്രാ ഭാരത്തിന്റെ 1/3-ൽ കൂടുതലാകരുത്.താൽപ്പര്യമുള്ള പ്രോട്ടീന്റെ തന്മാത്രാ ഭാരം ഏകദേശം 10 kd ആണെങ്കിൽ, 3 KD എന്ന തന്മാത്രാ ഭാരം കട്ട്-ഓഫ് ഉള്ള ഒരു അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ട്യൂബ് ഉപയോഗിക്കാം.
(2) പുതുതായി വാങ്ങിയ അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ വരണ്ടതാണ്, ഉപയോഗത്തിന് മുമ്പ് അൾട്രാപ്യൂർ വെള്ളം ചേർക്കുകയും കുറച്ച് മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് തണുപ്പിച്ച ഐസ് ബാത്ത് അല്ലെങ്കിൽ റഫ്രിജറേറ്റർ വഴി വെള്ളം പൂർണ്ണമായും കടന്നുപോകുകയും ചെയ്യും.പിന്നീട് വെള്ളം ഒഴിക്കുന്നു, അതായത് പ്രോട്ടീൻ ദ്രാവകം, എത്ര ചേർത്തു, ട്യൂബിന്റെ മുകളിലെ വെളുത്ത വരയിൽ കൂടുതലല്ലാത്തത്.പ്രവർത്തനം ഭാരം കുറഞ്ഞതാണ്, പ്രോട്ടീൻ ലായനി ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ് അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ട്യൂബ് ഐസിൽ തണുപ്പിക്കേണ്ടതുണ്ട്.
3) പിണ്ഡവും ഗുരുത്വാകർഷണ കേന്ദ്രവും സന്തുലിതാവസ്ഥയിൽ എത്തേണ്ടതായിരുന്നു.ഭ്രമണ വേഗതയും ആക്സിലറേഷനും വളരെ വേഗത്തിലല്ല, അല്ലാത്തപക്ഷം അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ മെംബ്രണിനെ നേരിട്ട് നശിപ്പിക്കുന്നത് ശ്രദ്ധിക്കുക.സെൻട്രിഫ്യൂഗൽ അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ആരംഭിച്ചു (സെൻട്രിഫ്യൂജ് 4 ഡിഗ്രി വരെ പ്രീ കൂൾഡ്).വ്യത്യസ്ത സെൻട്രിഫ്യൂജുകളുടെ ആർപിഎം g ആയി പരിവർത്തനം ചെയ്ത ശേഷം, അത് വ്യത്യസ്തമായിരുന്നു.സെൻട്രിഫ്യൂജിന്റെ ത്വരണം കുറഞ്ഞത് ആയി ക്രമീകരിച്ചു, ഇത് മെംബ്രണിലെ മർദ്ദം കുറയ്ക്കുന്നു.ശ്രദ്ധിക്കുക, സെൻട്രിഫ്യൂജ് ലക്ഷ്യസ്ഥാനത്ത് എത്തിയതിന് ശേഷം സെൻട്രിഫ്യൂജ് ഉപേക്ഷിക്കുന്നത് ഉറപ്പാക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ നിങ്ങൾക്ക് ഒരു പ്രശ്‌നമുണ്ടെങ്കിൽ, നിങ്ങൾക്ക് ആദ്യമായി അത് കൈകാര്യം ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല.സ്പിൻഡിലിലേക്കുള്ള മെംബ്രണിന്റെ ഓറിയന്റേഷൻ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് ക്രമീകരിച്ചു (കോണീയ സെൻട്രിഫ്യൂജ് കേസ് മെംബ്രൺ മുതൽ അച്ചുതണ്ട് ലംബമാണ്).പ്രായോഗിക ഉപയോഗത്തിൽ, പൊതു ഭ്രമണ വേഗത നിർദ്ദേശങ്ങളേക്കാൾ കുറവാണ്, അതിനാൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിന്റെ ആയുസ്സ് വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.
3) പിണ്ഡവും ഗുരുത്വാകർഷണ കേന്ദ്രവും സന്തുലിതാവസ്ഥയിൽ എത്തേണ്ടതായിരുന്നു.ഭ്രമണ വേഗതയും ആക്സിലറേഷനും വളരെ വേഗത്തിലല്ല, അല്ലാത്തപക്ഷം അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ മെംബ്രണിനെ നേരിട്ട് നശിപ്പിക്കുന്നത് ശ്രദ്ധിക്കുക.അപകേന്ദ്ര അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ആരംഭിച്ചു (സെൻട്രിഫ്യൂജ് 4 ഡിഗ്രി വരെ പ്രീ കൂൾഡ്).വ്യത്യസ്ത സെൻട്രിഫ്യൂജുകളുടെ ആർപിഎം g ആയി പരിവർത്തനം ചെയ്ത ശേഷം, അത് വ്യത്യസ്തമായിരുന്നു.സെൻട്രിഫ്യൂജിന്റെ ത്വരണം കുറഞ്ഞത് ആയി ക്രമീകരിച്ചു, ഇത് മെംബ്രണിലെ മർദ്ദം കുറയ്ക്കുന്നു.ശ്രദ്ധിക്കുക, സെൻട്രിഫ്യൂജ് ലക്ഷ്യസ്ഥാനത്ത് എത്തിയതിന് ശേഷം സെൻട്രിഫ്യൂജ് ഉപേക്ഷിക്കുന്നത് ഉറപ്പാക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ നിങ്ങൾക്ക് ഒരു പ്രശ്‌നമുണ്ടെങ്കിൽ, നിങ്ങൾക്ക് ആദ്യമായി അത് കൈകാര്യം ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല.സ്പിൻഡിലിലേക്കുള്ള മെംബ്രണിന്റെ ഓറിയന്റേഷൻ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് ക്രമീകരിച്ചു (കോണീയ സെൻട്രിഫ്യൂജ് കേസ് മെംബ്രൺ മുതൽ അച്ചുതണ്ട് ലംബമാണ്).പ്രായോഗിക ഉപയോഗത്തിൽ, പൊതു ഭ്രമണ വേഗത നിർദ്ദേശങ്ങളേക്കാൾ കുറവാണ്, അതിനാൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിന്റെ ആയുസ്സ് വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.
(4) ശേഷിക്കുന്ന 1ml ലേക്ക് കേന്ദ്രീകരിക്കുമ്പോൾ, 50ul ബഫർ ലായനി എടുത്ത്, 10ul ഫ്ലോ ത്രൂ ചേർക്കുക, അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ട്യൂബിൽ പ്രോട്ടീൻ ഇല്ലെങ്കിൽ എന്തെങ്കിലും നീല നിറം ഉണ്ടോ എന്ന് നോക്കുക.ട്യൂബ് ലീക്കാണെങ്കിൽ, അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ആരംഭിക്കുന്നതിന് മുകളിലെ പാളി വീണ്ടും ഒഴിച്ച് ഒരു പുതിയ ട്യൂബിലേക്ക് ഒഴുകുക.ട്യൂബുകൾ നഷ്ടമായോ എന്ന് കൃത്യമായി നിർണ്ണയിക്കാൻ, ഫ്ലോത്രൂവിന് മുമ്പ് 5mgml BSA ഉപയോഗിച്ച് 10 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുക, പ്രോട്ടീൻ ഗ്ലൂ അല്ലെങ്കിൽ ബ്രാഡ്‌ഫോർഡ് ക്രൂഡ് അസേയിൽ പ്രവർത്തിക്കുക, ശേഷിക്കുന്ന സാന്ദ്രീകൃത പ്രോട്ടീൻ ലായനി (ഇത് ഐസിൽ പ്രവർത്തിക്കുകയും പ്രോട്ടീനുകളെ ചൂടാക്കുന്നത് തടയുകയും ചെയ്യുന്നു) ചേർത്ത് തുടരുക. എല്ലാ ഏകാഗ്രതയും ചേർത്തു.പ്രോട്ടീനുകളുടെ അവശിഷ്ടം സംഭവിച്ചാൽ, ട്യൂബ് അടയ്ക്കുന്നതിന് ഇടയാക്കിയാൽ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ സമയത്ത് ശ്രദ്ധിക്കുക.മഴ പെയ്യുന്നുവെങ്കിൽ, അമിതമായ പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയാണോ അതോ അനുചിതമായ ബഫറാണോ മഴയുടെ പ്രത്യേക കാരണം എന്ന് നിർണ്ണയിക്കുക;ഒരേസമയം ഒന്നിലധികം അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ട്യൂബുകളുടെ അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ വഴിയും ഏകാഗ്രത കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെയും രണ്ടാമത്തേത് പ്രോട്ടീന്റെ അവശിഷ്ടം സംഭവിക്കുന്നത് വരെ വ്യത്യസ്ത ബഫർ ലായനികൾ കൈമാറ്റം ചെയ്യുന്നതിലൂടെയും ആദ്യത്തേത് പരിഹരിക്കാനാകും.
(4) ശേഷിക്കുന്ന 1ml ലേക്ക് കേന്ദ്രീകരിക്കുമ്പോൾ, 50ul ബഫർ ലായനി എടുത്ത്, 10ul ഫ്ലോ ത്രൂ ചേർക്കുക, അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ട്യൂബിൽ പ്രോട്ടീൻ ഇല്ലെങ്കിൽ എന്തെങ്കിലും നീല നിറം ഉണ്ടോ എന്ന് നോക്കുക.ട്യൂബ് ലീക്കാണെങ്കിൽ, അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ആരംഭിക്കുന്നതിന് മുകളിലെ പാളി വീണ്ടും ഒഴിച്ച് ഒരു പുതിയ ട്യൂബിലേക്ക് ഒഴുകുക.ട്യൂബുകൾ നഷ്ടമായോ എന്ന് കൃത്യമായി നിർണ്ണയിക്കാൻ, ഫ്ലോത്രൂവിന് മുമ്പ് 5mgml BSA ഉപയോഗിച്ച് 10 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുക, പ്രോട്ടീൻ ഗ്ലൂ അല്ലെങ്കിൽ ബ്രാഡ്‌ഫോർഡ് ക്രൂഡ് അസേയിൽ പ്രവർത്തിക്കുക, ശേഷിക്കുന്ന സാന്ദ്രീകൃത പ്രോട്ടീൻ ലായനി (ഇത് ഐസിൽ പ്രവർത്തിക്കുകയും പ്രോട്ടീനുകളെ ചൂടാക്കുന്നത് തടയുകയും ചെയ്യുന്നു) ചേർത്ത് തുടരുക. എല്ലാ ഏകാഗ്രതയും ചേർത്തു.പ്രോട്ടീനുകളുടെ അവശിഷ്ടം സംഭവിച്ചാൽ, ട്യൂബ് അടയ്ക്കുന്നതിന് ഇടയാക്കിയാൽ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ സമയത്ത് ശ്രദ്ധിക്കുക.മഴ പെയ്യുന്നുവെങ്കിൽ, അമിതമായ പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയാണോ അതോ അനുചിതമായ ബഫറാണോ മഴയുടെ പ്രത്യേക കാരണം എന്ന് നിർണ്ണയിക്കുക;ഒരേസമയം ഒന്നിലധികം അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ ട്യൂബുകളുടെ അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ വഴിയും ഏകാഗ്രത കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെയും രണ്ടാമത്തേത് പ്രോട്ടീന്റെ അവശിഷ്ടം സംഭവിക്കുന്നത് വരെ വ്യത്യസ്ത ബഫർ ലായനികൾ കൈമാറ്റം ചെയ്യുന്നതിലൂടെയും ആദ്യത്തേത് പരിഹരിക്കാനാകും.
(5) ആദ്യത്തെ കുറച്ച് ഘട്ടങ്ങൾ പ്രോട്ടീൻ കേന്ദ്രീകരിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു, ബഫർ മാറ്റണമെങ്കിൽ, പുതിയ ബഫർ (0.22um അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ മെംബ്രണിലൂടെയുള്ള അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ) മൊത്തം പ്രോട്ടീന്റെ ഏകദേശം 1ml എന്നതിലേക്ക് മൃദുവായി ചേർക്കുക, കൂടാതെ മൂന്നെണ്ണത്തിന് ഏകദേശം 1ml വരെ വീണ്ടും കേന്ദ്രീകരിക്കുക. തുടർച്ചയായ തവണ, ആവശ്യമുള്ള പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയെ ആശ്രയിച്ച് അന്തിമ സാന്ദ്രീകൃത അന്തിമ വോള്യം, സാധാരണയായി 500ul-ൽ കൂടരുത്, മാത്രമല്ല 200ul-നുള്ളിലും.ഓരോ തവണയും കുറഞ്ഞത് 10 × അല്ലെങ്കിൽ മറ്റെന്തെങ്കിലും വോളിയം സമ്പുഷ്ടീകരണം കണക്കാക്കിയാൽ, അടിസ്ഥാനപരമായി ബഫർ മാറ്റം പോലെ, മൂന്ന് അവസരങ്ങളിൽ 1000 × അല്ലെങ്കിൽ അതിൽ കൂടുതൽ നേടുക.
(5) ആദ്യത്തെ കുറച്ച് ഘട്ടങ്ങൾ പ്രോട്ടീൻ കേന്ദ്രീകരിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു, ബഫർ മാറ്റണമെങ്കിൽ, പുതിയ ബഫർ (0.22um അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ മെംബ്രണിലൂടെയുള്ള അൾട്രാഫിൽട്രേഷൻ) മൊത്തം പ്രോട്ടീന്റെ ഏകദേശം 1ml എന്നതിലേക്ക് മൃദുവായി ചേർക്കുക, കൂടാതെ മൂന്നെണ്ണത്തിന് ഏകദേശം 1ml വരെ വീണ്ടും കേന്ദ്രീകരിക്കുക. തുടർച്ചയായ തവണ, ആവശ്യമുള്ള പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയെ ആശ്രയിച്ച് അന്തിമ സാന്ദ്രീകൃത അന്തിമ വോള്യം, സാധാരണയായി 500ul-ൽ കൂടരുത്, മാത്രമല്ല 200ul-നുള്ളിലും.ഓരോ തവണയും കുറഞ്ഞത് 10 × അല്ലെങ്കിൽ മറ്റെന്തെങ്കിലും വോളിയം സമ്പുഷ്ടീകരണം കണക്കാക്കിയാൽ, അടിസ്ഥാനപരമായി ബഫർ മാറ്റം പോലെ, മൂന്ന് അവസരങ്ങളിൽ 1000 × അല്ലെങ്കിൽ അതിൽ കൂടുതൽ നേടുക.
പോസ്റ്റ് സമയം: നവംബർ-09-2022