തന്മാത്രാ രോഗനിർണയം, സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന PCR സാങ്കേതികവിദ്യയും തത്വവും

പിസിആർ, പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ ആണ്, ഇത് ഡിഎൻ‌എ പോളിമറേസിന്റെ കാറ്റലിസിസിന് കീഴിലുള്ള സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് dNTP, Mg2+, നീട്ടൽ ഘടകങ്ങൾ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ മെച്ചപ്പെടുത്തൽ ഘടകങ്ങൾ എന്നിവയുടെ കൂട്ടിച്ചേർക്കലിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, പാരന്റ് ഡിഎൻഎയെ ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായും നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ വിപുലീകരണത്തിന്റെ ആരംഭ പോയിന്റായും ഉപയോഗിക്കുന്നു , ഡിനാറ്ററേഷൻ, അനീലിംഗ്, എക്സ്റ്റൻഷൻ മുതലായവയുടെ ഘട്ടങ്ങളിലൂടെ, പാരന്റ് സ്‌ട്രാൻഡ് ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎയ്‌ക്ക് പൂരകമായ മകൾ സ്‌ട്രാൻഡ് ഡിഎൻഎയെ പകർപ്പെടുക്കുന്ന ഇൻ വിട്രോ പ്രക്രിയയ്ക്ക് വിട്രോയിലെ ഏത് ലക്ഷ്യ ഡിഎൻഎയെയും വേഗത്തിലും പ്രത്യേകമായും വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.

1. ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ട് പിസിആർ

പരമ്പരാഗത PCR-ൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ ആരംഭ സമയം PCR മെഷീനിൽ PCR മെഷീൻ ഇടരുത്, തുടർന്ന് പ്രോഗ്രാം വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ തുടങ്ങുന്നു.സിസ്റ്റം കോൺഫിഗറേഷൻ പൂർത്തിയാകുമ്പോൾ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ആരംഭിക്കുന്നു, ഇത് നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് കാരണമായേക്കാം, കൂടാതെ ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് പിസിആറിന് ഈ പ്രശ്നം പരിഹരിക്കാൻ കഴിയും.

എന്താണ് ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ട് PCR?പ്രതികരണ സംവിധാനം തയ്യാറാക്കിയ ശേഷം, എൻസൈം മോഡിഫയർ ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിൽ (സാധാരണയായി 90 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലും കൂടുതലാണ്) പ്രതികരണത്തിന്റെ പ്രാരംഭ തപീകരണ ഘട്ടത്തിലോ "ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ട്" ഘട്ടത്തിലോ പുറത്തുവിടുന്നു, അങ്ങനെ ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് സജീവമാകും.കൃത്യമായ ആക്ടിവേഷൻ സമയവും താപനിലയും ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെയും ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് മോഡിഫയറിന്റെയും സ്വഭാവത്തെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ പ്രവർത്തനത്തെ തടയാൻ ആന്റിബോഡികൾ, അഫിനിറ്റി ലിഗാൻഡുകൾ, അല്ലെങ്കിൽ കെമിക്കൽ മോഡിഫയറുകൾ തുടങ്ങിയ മോഡിഫയറുകൾ ഈ രീതി പ്രധാനമായും ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഊഷ്മാവിൽ ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ പ്രവർത്തനം തടസ്സപ്പെടുന്നതിനാൽ, പിസിആർ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളുടെ പ്രത്യേകതകൾ നഷ്ടപ്പെടുത്താതെ ഊഷ്മാവിൽ ഒന്നിലധികം പിസിആർ പ്രതികരണ സംവിധാനങ്ങൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിന് ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ട് സാങ്കേതികവിദ്യ വലിയ സൗകര്യം നൽകുന്നു.

2. RT-PCR

RT-PCR (റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ PCR) എന്നത് mRNA-യിൽ നിന്ന് cDNA-യിലേക്ക് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ഒരു പരീക്ഷണാത്മക സാങ്കേതികതയാണ്.ആദ്യം ടിഷ്യൂകളിലോ കോശങ്ങളിലോ മൊത്തം ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുക, ഒലിഗോ (ഡിടി) ഒരു പ്രൈമറായി ഉപയോഗിക്കുക, സിഡിഎൻഎ സമന്വയിപ്പിക്കുന്നതിന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് ടാർഗെറ്റ് ജീൻ നേടുന്നതിനോ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ കണ്ടെത്തുന്നതിനോ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി സിഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുക എന്നതാണ് പരീക്ഷണാത്മക നടപടിക്രമം.

3. ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ

ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ (റിയൽ-ടൈം ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ,RT-qPCR) പിസിആർ റിയാക്ഷൻ സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പുകൾ ചേർക്കുന്ന രീതിയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലുകളുടെ ശേഖരണം ഉപയോഗിച്ച് മുഴുവൻ പിസിആർ പ്രക്രിയയും തത്സമയം നിരീക്ഷിക്കുകയും ഒടുവിൽ ടെംപ്ലേറ്റ് അളവ് വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിന് സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന qPCR രീതികളിൽ SYBR ഗ്രീൻ I, TaqMan എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.

4. നെസ്റ്റഡ് പിസിആർ

രണ്ട് റൗണ്ട് പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി രണ്ട് സെറ്റ് പിസിആർ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനെ നെസ്റ്റഡ് പിസിആർ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, രണ്ടാം റൗണ്ടിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നം ടാർഗെറ്റ് ജീൻ ശകലമാണ്.

ആദ്യ ജോടി പ്രൈമറുകളുടെ (ഔട്ടർ പ്രൈമറുകൾ) പൊരുത്തക്കേട് ഒരു നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ഉൽപ്പന്നം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് കാരണമാകുകയാണെങ്കിൽ, അതേ നോൺ-സ്പെസിഫിക് മേഖലയെ രണ്ടാമത്തെ ജോടി പ്രൈമറുകൾ തിരിച്ചറിയുകയും ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്യുന്നത് തുടരുകയും ചെയ്യാനുള്ള സാധ്യത വളരെ ചെറുതാണ്, അതിനാൽ രണ്ടാമത്തെ ജോഡി പ്രൈമറുകൾ വഴി ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ, പിസിആറിന്റെ പ്രത്യേകത മെച്ചപ്പെടുത്തി.രണ്ട് റൗണ്ട് പിസിആർ നടത്തുന്നതിന്റെ ഒരു ഗുണം, പരിമിതമായ ആരംഭ ഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് മതിയായ ഉൽപ്പന്നം വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ഇത് സഹായിക്കുന്നു എന്നതാണ്.

5. ടച്ച്ഡൗൺ പിസിആർ

PCR സൈക്കിൾ പാരാമീറ്ററുകൾ ക്രമീകരിച്ചുകൊണ്ട് PCR പ്രതികരണത്തിന്റെ പ്രത്യേകത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള ഒരു രീതിയാണ് Touchdown PCR.

ടച്ച്‌ഡൗൺ പിസിആറിൽ, ആദ്യത്തെ കുറച്ച് സൈക്കിളുകൾക്കുള്ള അനീലിംഗ് താപനില പ്രൈമറുകളുടെ പരമാവധി അനീലിംഗ് താപനിലയേക്കാൾ (ടിഎം) കുറച്ച് ഡിഗ്രി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.ഉയർന്ന അനീലിംഗ് താപനില നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഫലപ്രദമായി കുറയ്ക്കും, എന്നാൽ അതേ സമയം, ഉയർന്ന അനീലിംഗ് താപനില പ്രൈമറുകളുടെയും ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസുകളുടെയും വേർതിരിവ് വർദ്ധിപ്പിക്കും, അതിന്റെ ഫലമായി പിസിആർ വിളവ് കുറയുന്നു.അതിനാൽ, ആദ്യത്തെ കുറച്ച് സൈക്കിളുകളിൽ, സിസ്റ്റത്തിലെ ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ ഉള്ളടക്കം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് അനീലിംഗ് താപനില സാധാരണയായി ഓരോ സൈക്കിളിനും 1 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ് കുറയാൻ സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.അനീലിംഗ് താപനില ഒപ്റ്റിമൽ താപനിലയിലേക്ക് താഴ്ത്തുമ്പോൾ, ശേഷിക്കുന്ന സൈക്കിളുകളിൽ അനീലിംഗ് താപനില നിലനിർത്തുന്നു.

6. നേരിട്ടുള്ള പിസിആർ

ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഐസൊലേഷനും ശുദ്ധീകരണവും ആവശ്യമില്ലാതെ സാമ്പിളിൽ നിന്ന് നേരിട്ട് ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനെയാണ് ഡയറക്ട് പിസിആർ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്.

നേരിട്ടുള്ള പിസിആർ രണ്ട് തരത്തിലുണ്ട്:

നേരിട്ടുള്ള രീതി: പിസിആർ ഐഡന്റിഫിക്കേഷനായി ഒരു ചെറിയ സാമ്പിൾ എടുത്ത് നേരിട്ട് പിസിആർ മാസ്റ്റർ മിക്സിലേക്ക് ചേർക്കുക;

ക്രാക്കിംഗ് രീതി: സാമ്പിൾ സാമ്പിൾ ചെയ്ത ശേഷം, അത് ലൈസറ്റിലേക്ക് ചേർക്കുക, ജീനോം പുറത്തുവിടാൻ ലൈസ് ചെയ്യുക, ചെറിയ അളവിൽ ലൈസ്ഡ് സൂപ്പർനാറ്റന്റ് എടുത്ത് പിസിആർ മാസ്റ്റർ മിക്സിൽ ചേർക്കുക, പിസിആർ ഐഡന്റിഫിക്കേഷൻ നടത്തുക.ഈ സമീപനം പരീക്ഷണാടിസ്ഥാനത്തിലുള്ള വർക്ക്ഫ്ലോ ലളിതമാക്കുന്നു, സമയം കുറയ്ക്കുന്നു, ശുദ്ധീകരണ ഘട്ടങ്ങളിൽ ഡിഎൻഎ നഷ്ടം ഒഴിവാക്കുന്നു.

7. SOE PCR

ഓവർലാപ്പ് എക്സ്റ്റൻഷൻ പിസിആർ (എസ്ഒഇ പിസിആർ) വഴിയുള്ള ജീൻ വിഭജനം, പിസിആർ ഉൽപന്നങ്ങൾ ഓവർലാപ്പിംഗ് ചെയിനുകൾ ഉണ്ടാക്കാൻ കോംപ്ലിമെന്ററി അറ്റങ്ങളുള്ള പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു, അങ്ങനെ തുടർന്നുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതികരണത്തിൽ, ഓവർലാപ്പിംഗ് ശൃംഖലകളുടെ വിപുലീകരണത്തിലൂടെ, ആംപ്ലിഫൈഡ് ശകലങ്ങൾ ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്ന സാങ്കേതികതയുടെ വ്യത്യസ്ത ഉറവിടങ്ങൾ. ഒപ്പം പിളർന്നു.ഈ സാങ്കേതികവിദ്യയ്ക്ക് നിലവിൽ രണ്ട് പ്രധാന പ്രയോഗ ദിശകളുണ്ട്: ഫ്യൂഷൻ ജീനുകളുടെ നിർമ്മാണം;ജീൻ സൈറ്റ്-ഡയറക്ടഡ് മ്യൂട്ടേഷൻ.

8. ഐ.പി.സി.ആർ

രണ്ട് പ്രൈമറുകൾ ഒഴികെയുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് വിപരീത പിസിആർ (ഐപിസിആർ) റിവേഴ്സ് കോംപ്ലിമെന്ററി പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ അറിയപ്പെടുന്ന ഡിഎൻഎ ശകലത്തിന്റെ ഇരുവശത്തും അജ്ഞാത ശ്രേണികൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു.

IPCR യഥാർത്ഥത്തിൽ രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരിക്കുന്നത് അടുത്തുള്ള അജ്ഞാത പ്രദേശങ്ങളുടെ ക്രമം നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനാണ്, ഇത് കൂടുതലും ഉപയോഗിക്കുന്നത് ജീൻ പ്രൊമോട്ടർ സീക്വൻസുകൾ പഠിക്കാനാണ്;ജീൻ ഫ്യൂഷൻ, ട്രാൻസ്‌ലോക്കേഷൻ, ട്രാൻസ്‌പോസിഷൻ തുടങ്ങിയ ഓങ്കോജെനിക് ക്രോമസോം പുനഃക്രമീകരണങ്ങൾ;കൂടാതെ വൈറൽ ജീൻ സംയോജനവും ഇപ്പോൾ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കപ്പെടുന്നു, സൈറ്റ്-ഡയറക്ടഡ് മ്യൂട്ടജെനിസിനായി, ആവശ്യമുള്ള മ്യൂട്ടേഷനോടുകൂടിയ ഒരു പ്ലാസ്മിഡ് പകർത്തുക.

9. ഡിപിസിആർ

ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് തന്മാത്രകളുടെ സമ്പൂർണ്ണ അളവ് നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു സാങ്കേതികതയാണ് ഡിജിറ്റൽ PCR (dPCR).

ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് തന്മാത്രകളുടെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കാൻ നിലവിൽ മൂന്ന് രീതികളുണ്ട്.ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് തന്മാത്രകളുടെ ആഗിരണം അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് ഫോട്ടോമെട്രി;തൽസമയ ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR (റിയൽ ടൈം PCR) Ct മൂല്യത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്, കൂടാതെ Ct മൂല്യം കണ്ടെത്താനാകുന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് മൂല്യവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സൈക്കിൾ നമ്പറിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു;ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് അളവ് കണക്കാക്കുന്നതിനുള്ള സിംഗിൾ-മോളിക്യൂൾ പിസിആർ രീതി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഏറ്റവും പുതിയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് സാങ്കേതികവിദ്യയാണ് ഡിജിറ്റൽ പിസിആർ.